I.
TECHNIQUES DE MARQUAGE
La réaction antigène-anticorps est rendue visible par
un marquage préalable de l'antigène, de L’anticorps ou d'une anti-globuline
(anti-Ig ou anti-C).
Différents marqueurs sont utilisés :
- corps fluorescents
: immunofluorescence (IF)
- enzymes :
immuno-enzymologie (EIA)
- éléments radioactifs
: radio-immunologie (RIA)
 |
| Marquage des antigènes et des anticorps |
Dans les réactions utilisant un marquage, le problème
est de pouvoir distinguer le corps marqué qui a réagi dans la réaction Ag-Ac,
de celui qui est resté libre.
En fonction de la modification ou non de l'activité du
marqueur enzymatique lors de la réaction Ag-Ac, on a les deux schémas réactionnels
:
·
Dansles techniques en phase homogène,
l'activité du marqueur est modifiée par la réactionAg-Ac (extinction du signal)
et permet de révéler directement le développement de la réactionAg-Ac. L'Ac =
réactif liant et révélateur de la formation du complexe spécifique d'où
uneétape de séparation inutile.
·
Dansles techniques en phase hétérogène, le comportement du marqueur est inchangé par
laréaction Ag-Ac ; une étape de séparation est obligatoire entre les complexes
Ag-Ac marquésformés d'une part et l'Ag ou l'Ac marqué resté libre d'autre part,
avant la lecture du signalfixé.
1. Immunofluorescence
Méthode qui utilise un marquage par un corps
fluorescent pour déceler une réaction Ag-Ac.
On marque l'anticorps ou l'antigène ou encore un
réactif réagissant avec le complexe Ag-Ac.
A- Principes fondamentaux
A.1
La fluorescence :
= Phénomène physique : absorption d’un rayonnement par
une molécule et émission d’une lumière de plus faible énergie.
A.2
Les fluorochromes :
Fluorescéine (Isothiocyanate de), Rhodamine,
Phycoérythrine.
A.3
Microscope à fluorescence :
Source lumineuse : lampe à vapeur de Hg
Filtres d’excitation
Miroir séparateur dichroïque
Filtre d’arrêt
B- Le système
immunologique
B.1
Antigènes :
Coupes d’organes, frottis de micro-organismes ou
cellules, suspension de cellules
B.2 Conjugaison
au fluorochrome
De l'anticorps ou immunoglobuline, de l’antigène
C- Méthodes
C.1
Immunofluorescence directe :
La réaction se fait en un temps : le
réactif, antigène ou anticorps, marqué avec le
Fluorochrome permet de déceler l'anticorps ou
l'antigène correspondant.
C.2
Immunofluorescence indirecte :
Méthode en deux
temps:
1er temps - on fait agir un anticorps non
marqué qui se fixe spécifiquement sur l'antigène
2ème temps - après lavage pour éliminer le
premier réactif en excès, on fait agir une
Antiglobuline fluorescente révélatrice de la fixation
de l'anticorps du premier temps (= deux réactions Ag-Ac successives).
·
Mise en évidence de l'antigène,
·
Mise en évidence d'Ac dans le sérum.
C.3
Cytométrie de flux :
Numération de cellules exprimant des Ag au sein d'une
suspension hétérogène :
Les cellules de l'échantillon sont marquées avec des
réactifs fluorescents qui se fixent
Spécifiquement à des molécules de la surface
cellulaire (ex : anti-CD4, anti-CD8...)
Les cellules sont entraînées dans une veine liquide.
Chaque cellule passe devant un faisceau laser. Le système mesure la diffusion
de la lumière aux petits angles, à angle droit et lesintensités de fluorescence
pour trois longueurs d'ondes différentes. Grâce à des filtres et
desphotomultiplicateurs, l'appareil enregistre l'intensité de fluorescence de
chaque cellule passantdevant la source laser.
Les résultats sont présentés sous la forme
d'histogrammes. Permet une analyse
Multiparamétrique en déterminant pour chaque cellule,
la taille, la granulosité, l'intensité de fluorescence avec différents
fluorochromes.
2. Radio-immunologie, immun enzymologie
1- Principe :
Met à profit le signal émis par les molécules marquées
par un radio-isotope :RIA =
Radio Immuno Assay ou
une enzyme :ELISA =
Enzyme Immuno
SorbentAssay.
Permet la mise en évidence et le dosage de substances
présentes en très faible quantité dans les milieux complexes, en associant
l'utilisation de la spécificité très stricte de la combinaisonAg-Ac mise en jeu
dans la réaction et l'introduction d'un signal très sensible marquant cettecombinaison.
Radio-immunologie :
·
Révélation du complexe Ag-Ac radioactif par un
compteur
Immuno-enzymologie :
·
Révélation du complexe Ag-Ac marqué par l’enzyme par
mise Enprésence du substrat spécifique de cette enzyme.
2- Méthodes :
2.1
Analyse par méthode indirecte (ELISA indirect) :
Permet le dosage d’anticorps.
- l’échantillon contenant l’Ac primaire (Ac1) est
déposé dans un puits où est adsorbé
L’antigène, avec lequel il réagit,
- après lavage, la présence de l’Ac1 est détectée en
ajoutant un Ac secondaire (Ac2) Anti-isotype conjugué à un enzyme,
- l’Ac2 libre est éliminé par lavage, et un substrat de
l’enzyme est ajouté
- la quantité de produit coloré est mesurée par un lecteur
spectrophotométrique approprié.
2.2
Analyse par compétition :
On dispose :
- d'un liquide biologique contenant une substance X à
doser qui constitue l'antigène "froid" (Ag°) en quantité inconnue;
- de l'anticorps spécifique anti-X en quantité fixe et
limitée fixé sur un support solide (tube ou plaque de polystyrène par ex).
- d'un traceur constitué de l'antigène marqué (Ag*)
identique à l'antigène X à doser, en quantité fixe et très faible.
- Compétition entre l’Ag marqué et l’Ag non marqué à
doser : les complexes Ag°-Ac et Ag*-Ac se forment selon la loi d'action de
masse.
- Lavage pour éliminer les réactifs non fixés et
séparer phase libre et liée du marqueur
- Mesure du signal final fixé sur le support qui est
inverse de la quantité d'Ag à doser fixer, par référence à une courbe
d'étalonnage
- en phase solide, Ac est fixé sur un support solide ;
un simple lavage suffit pour séparer phase libre et liée du marqueur.
2.3
Analyse immunométrique :
On met en jeu un excès d'anticorps.
Basée sur protocole dit"sandwich"
ou "à deux sites"
La réaction sera totale (et non à l'équilibre). Ce
sont les molécules d'anticorps qui sont marquées (sauf exception).
Après des lavages, le signal fixé est mesuré, il est
proportionnel à la concentration d'Ag à doser par référence à une courbe
d'étalonnage.
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