rapport de stage au laboratoire d'analyses médicales : CHAPITRE II

CHAPITRE II :

                                                                             I.        La phase pré-analytique

C'est la première phase de l'analyse médicale. Elle comprend l'état du patient (à jeun ou non), la phase de prélèvement, celle de l'étiquetage des échantillons prélevées, de l'enregistrement des demandes d'analyses, de la centrifugation des prélèvements et de leur prétraitement éventuel (décantation). Pendant cette étape un certain nombre d'opérations peut fausser les résultats, c’est pour cela que lorsque le laboratoire reçoit des prélèvements non conformes à ses spécifications, il se doit d’entreprendre toute action corrective visant à améliorer la qualité des prélèvements reçus. 

 Il faut mentionner que la couleur d’un tube indique la nature et le service capable d’analyser ce dernier, comme dans le tableau ci-dessous :

Rouge	Biochimie, Sérologie
Violet	Hématologie, Biologie moléculaire, Immuno-phynotypage,Sérologie
Bleu	Hémostase
Noire	Vitesse de sédimentation, Groupage

Tableau : la couleur courante pour le service dans le laboratoire

1-L’enregistrement du patient :

ü  Où ?    À l’accueil …Comment ?Numéro d’enregistrement et code identifiant

ü  Pour les laboratoires qui disposent de SIGL(Système Informatisé de Gestion des données)

ü  Dans tous les cas : numéro/code reporté sur tous les prélèvements du patient.

2-Salle de prélèvement :

ü Salle il faut être propre aérée ayant une bonne luminosité, et différente des salles de manipulation.

3-Le plateau de prélèvement :

ü  Matérield’asepsie.

ü  Les tubes de différentscouleurs qui indiquent la nature et le service capable d’analyser ces derniers.

ü  Matériel à usage unique.

4-Technique de prélèvement :

Sans garrot ou avec garrot moins d’une minute

Ponction veineuse franche

Prélèvement sous vide de préférence

Prélèvement de sang en raison de :

ü  9 Volumes de sang pour 1 volume d’anticoagulantCITRAT pour le tube bleu 

ü  4 volume de sang pour 1 volume d’anticoagulant CITRATpour le tube noir

ü  9 volume de sang pour 1 volume d’anticoagulant EDTA pour le tube violet

ü  Le tube rouge est SECne contient aucun anticoagulant

5-Triage des échantillons (Sang, Urine, LCR…)

Le triage des échantillons commence par la classification des différents liquides à analysées, selon leur nature, c’est -à-dire chaque liquide biologique a une paillasse bien précise puis ces liquides biologiques subissent une deuxième classification basée sur la source des patients : si le patient est hospitalisé au sein de l’hôpital il sera nommé ‘ interne’, par contre si le patient est non hospitalisé il sera nommé ’ externe’.

6- Centrifugation

   La centrifugation est un procédé de séparation des composés d’un mélange en fonction de leur différence de densité en les soumettant a une force centrifuge. Le mélange à séparer peut être constitue soit de deux phases liquides, soit de particules solides en suspension dans un fluide. L’appareil utilisé est une machine tournante à grande vitesse appelée centrifugeuse.

                                                                                      II.        Phase analytique

Cette phase concerne la mise en analyse soit manuellement soit à travers l’automate.

Exemple : Sérologie 

La sérologie est une méthode biologique utilisant le sérum pour établirdes diagnostics médicaux. Le sérum est un constituant du plasma sanguin. Lors d'une prise de sang, le biologiste va analyser le sérum. La sérologie permet de poser un diagnostic des maladies infectieuses, des maladies auto-immunes, de déterminer les groupes sanguins, de suivre l'évolution de certaines maladies, de vérifier les vaccinations,La sérologie est aussi un outil de dépistage, notamment pour le SIDA ,les hépatites ou la syphilis ainsi qu'un outil épidémiologique.

1-Sida :

Le virus du sida fait partie de la famille des rétrovirus sous-groupe des lentivirus, possédant un génome sous forme d'ARN, Son nom correspond à son effet pathologique : VIH = Virus de l'Immunodéficience Humaine sexuellement transmissible, très variable et pas de vaccin et traitement curatif.

  La maladie qu'il cause chez l'Homme est le SIDA : Syndrome d'Immunodéficience Acquise.

1.2-Les analyses de dépistage :

A.Test dépistage rapide (TDR) :

Un test de dépistage rapide VIH est un test unitaire qui permet d'obtenir un résultat rapide et ce via la détection des anticorps anti-VIH en moins de trente minutes, après prélèvement d'une simple goutte de sang au bout du doigt ou on utilisent le sérum ou plasma.
Faciles à manipuler, ils sont réalisés avec les mêmes antigènes que ceux utilisés pour produire les tests ELISA, Ils sont bases sur la migration de microparticules le long d’une membrane (principe d’immuno-chromatographie).

Pour réaliser un test rapide on Préparer tout le matériel nécessaire pour la manipulation ont Utilisent les bandelettes séparément puis on Marquer la bandelette avec l’identifiant du patient (Numéro de succession) enfin on Ouvrir la bandelette et déposer 50 μl du spécimen (sang total /plasma ou sérum) sur la zone de dépôt de la bandelette et Pour le sang total ajouter une goutte du tampon et on le laisse 15 minutes, après on lire et reporter les résultats.

Les TDR permettent de répondre a deux objectifs :

·        Diagnostic rapide dans certaines situations d’urgence :

 Mise en œuvre d’une prise en charge adaptée

·        Accès facile à la connaissance du statut sérologique :

 Prise en charge préventive et thérapeutique de l’infection à VIH chez les popq          qui n’ont pas ou insuffisamment recours au dépistage classique.

A.1 Avantages du diagnostic par test rapide :

ü  Facilité d’emploi.

ü  Facilite d’interprétation.

ü  Stockage à température ambiante.

ü  Facilite de conservation des kits.

ü  Réalisable en tout lieu et tout endroit.

ü   Ne nécessite pas d’équipement pour traiter l’échantillon

ü  Résultat en un temps < 30 minutes.

ü  Coût faible.

ü  L’accessibilité sur le marche

ü  Augmente l’accessibilité aux structure offrant le dépistage

ü  Augmentation du nombre de sites ou le test est disponible.

ü  Counseling et diagnostic le même jour.

ü  Test prêt à l’emploi

ü  Test robuste

ü  Pas de réactif à reconstituer

ü  Niveau satisfaisant de sensibilité et de spécificité (littérature scientifique)

A.2 Principe des tests rapids VIH:

•         TDR sont basés sur la présence d’antigènescorrespondant exclusivement aux antigènes d’enveloppe des VIH 1 et VIH2

•         Ils sont basés sur les principes :

ü  Immunoconcentration (flux vertical)

ü  Immunochromatographie (flux latéral)

ü  Agglutination.

A.3Interpretation des résultats:

A.4 Limits des tests rapids:

ü  Résultat faussement positif (réaction croisée avec d’autre infection virale/parasitaire ou bactérienne), d’où l’intérêt de la confirmation par Western blot

ü  Problème de la fenêtre sérologique

ü  Discrimination VIH1 / VIH2

ü  Usage chez les bébés nés de mères séropositives.

2-syphilis 

Une maladieInfection Sexuellement Transmissible (IST) causée par l’agent infectieuxtréponema pallidum.

2.1 Evolution de la maladie :

Stade primaire:

L’apparition duchancre contenant Treponema pallidum

Tests sérologiques : négatifs.

Stade secondaire:

(2 à 6 mois après contact) Treponema pallidumpasse dans le sang et contamine divers tissus.Apparitions de lésions cutanées et muqueuses.

Tests sérologiques :Positifs

Stade tertiaire:

5 à 10 ans après le stade primaire, caractérisé par diverses atteintes graves : osseuses, cardio-vasculaires, neurologiques

Maladie congénitale :

Transmission de la mère au fœtus.

2.2 Antigènes de Treponema pallidum et sérodiagnostic :

ü Enveloppe : Antigène polyosidiqueSpécifique de l’espèce Treponema pallidum.

è TPHA : recherche des anticorps sériques anti-polyoside

ü Paroi : Antigène cardiolipidiquecommun aux Tréponèmes, bactéries et certains tissus animaux (ex : cœur de bœuf)

è VDRL : recherche des anticorps sériques anti-cardiolipide.

3.Les analyses de dépistage :

A. Test du Treponema pallidum hémagglutination assay(TPHA) :

PRINCIPE :

On recherche dans le sérum la présence ou non d’anticorps dirigés contre le polyoside d’enveloppe.

ü  Détection des anticorps par réaction d’AGGLUTINATION DIRECTE PASSIVE

ü  Ce test est QUANTITATIF

ANTIGENES MIS EN JEU :

Les anticorps recherchés sont dirigés contre l’ANTIGÈNE POLYOSIDIQUE:

Constituant de l’enveloppe spécifiquede Treponema pallidum.

A.1-Les réactifs :

Hématies antigène :

è Hématies de poulet sensibilisées par un lysat de Treponema pallidum et additionnées d’un extrait de Treponema de Reiter

L’extrait de Treponema de Reiter permet de neutraliser les anticorps qui ne sont pas spécifiques de Treponema pallidum.

Hématies témoin :

Hématies de poulet additionnées d’un extrait de Treponema de Reiter

·        Sérum (humain) de contrôle positif :prédilué au 1/20

·        Sérum (humain) de contrôle négatif :prédilué au 1/20

·        Diluant : NaCl à 0,15 mol/L, pH = 7,3

A.2-Les résultats :

B. Test du Veneral Disease Research Laboratory(VDRL) :

PRINCIPE :

On recherche dans le sérum la présence ou non d’anticorps dirigés contre le cardiolipide(anticorps anti-cardiolipide ou réagines de Wassermann).

ü  Détection des anticorps par réaction d’AGGLUTINATION DIRECTE PASSIVE

ü  Ce test est QUALITATIF

ANTIGENES MIS EN JEU :

Les anticorps recherchés sont dirigés contre l’ANTIGÈNE CARDIOLIPIDIQUE :

ü  Constituant de la paroi commune à tous les tréponèmes, mais aussi à des bactéries, des végétaux et certains tissus animaux.

B.2 Les résultats : (l’observation fait par le microscope)

ü En présence d’AGGLUTINATION : donc il y a présence d’anticorps anti-cardiolipide dans le sérum testé.

ü  En absence d’AGGLUTINATION : donc il y a Absence d’anticorps anti-cardiolipide dans le sérum testé.

3.Marqueurs tumoraux :

La transformation d’une cellule normale en cellule tumorales’accompagne de nombreux changements : différenciationmorphologique, modification des métabolismes, nouvellespropriétés à la surface cellulaire, dérépression de gènesnormalement réprimés… Le marqueur tumoral se définitalors comme une substance excrétée dans le sang par latumeur. On peut donc le détecter et le doser par lesméthodes d’immunoanalyse.

3.1 Indications :

– Le dosage des marqueurs ne présente aucun intérêt pour le dépistage de cancers. Les taux peuvent être normaux ou bas, même en présence d’un cancer.

– Il peut être utile en complément du diagnostic anatomopathologique du cancer.

– Intérêt pronostique : il reflète l’extension tumorale.

– Evaluation de l’efficacité thérapeutique : normalisation des valeurs si le traitement est efficace ; augmentation en cas de résistance au traitement ; diminution, puis augmentation, en cas d’échappement thérapeutique.

– Surveillance des récidives : l’augmentation du marqueur tumoral peut précéder de quelques mois à deux ans la rechute clinique et permettre une reprise précoce du traitement.

– Dans les pathologies métastatiques, d’emblée : recherche de la tumeur primitive par le dosage de plusieurs marqueurs.

3.2 Conditions de prélèvement

Dosage dans le sang (sérum ou plasma).

• La congélation des échantillons est possible.

3.3 Valeurs usuelles

Les seuils de décision pathologique sont difficiles à Fixer, la sensibilité et la spécificité des marqueurs tumoraux n’étant pastotales. Les résultats peuvent être normaux alors qu’il existe unepathologie maligne et, à l’inverse, des situations non tumorales peuvententraîner des valeurs anormales.

3.4 Classification

Il existe deux groupes principaux de marqueurs tumoraux.

è Les antigènes de tumeur ou carbohydrates : CA 19-9, CA 125, CA 15-3

(CA correspond à Cancer Antigen et le chiffre définit l’anticorps correspondant.)

•CA 19-9

– Nature : glycolipide, dérivé sialylé de l’antigène érythrocytaire de Lewis.

– Demi-vie : 2 semaines.

– Valeur seuil : 35 UI/ml.

– Pathologies malignes : tumeurs digestives (pancréas, estomac), cancer épithélial mucineux de l’ovaire.

– Pathologies bénignes : maladies inflammatoires, hépatite chronique, pancréatite.

• CA 125

– Nature : glycoprotéine de 1 000 kDa, demi-vie = 5 jours.

– Présent dans le tissu épithélial génital normal.

– Valeur seuil : 35 UI/ml.

– Pathologies malignes : tumeurs séreuses de l’ovaire, cancer du pancréas, du foie, du poumon.

– Pathologies bénignes : cirrhose décompensée.

– Augmentation physiologique en cas de grossesse et au début du cycle menstruel.

• CA 15-3

– Nature : glycoprotéine de type mucineuse de 400 kDa ;

– Demi-vie : 2 semaines.

– Valeur seuil : 30 UI/ml.

– Pathologies malignes : cancer du sein, cancer bronchique, cancer de l’ovaire.

– Pathologies bénignes : tumeurs bénignes du sein, cirrhose, bronchite chronique.

è Les antigènes onco-foetaux : a-Foetoprotéine, ACE.

• ACE

– Nature : glycoprotéine complexe (5 épitopes différents) de 200 kDa dont la synthèse est stoppée après la naissance.

– Demi-vie : plusieurs semaines.

– Valeur seuil : 5 ng/ml.

– Pathologies malignes : cancer du sein, du tube digestif (côlon), de l’ovaire, de l’utérus, du poumon, cancer médullaire de la thyroïde.

– Pathologies bénignes : tabagisme, alcoolisme, pathologies inflammatoires digestives.

•aa-foetoprotéine

– Nature : glycoprotéine de 70 kDa, synthétisée par la membrane vitelline, le tractus intestinal et le foie fœtal. Sa valeur devient nulle vers 4 mois.

– Demi-vie : 5 jours.

– Valeur seuil : 15 μg/l.

– Pathologies malignes : hépatocarcinome, tumeur du testicule, cancers bronchiques et digestifs (pancréas).

– Pathologies bénignes : hépatite virale, cirrhose.

– Augmentation physiologique pendant la grossesse (de la 6e à la 32e semaine).