rapport de stage au laboratoire d'analyses médicales : CHAPITRE I

CHAPITRE I

TECHNIQUES D’IMMUNOANALYSE

La spécificité de la réaction Ag-Ac permet :

- la recherche, l'identification ou le dosage de toute molécule capable d'induire la production d'anticorps

- la recherche, l'identification ou le dosage d'anticorps grâce à l'antigène correspondant.

Liaison Ag-Ac--->Réaction équilibrée

                                Réaction réversible.

Lors de la réaction Ag-Ac, deux cas peuvent se présenter :

On peut observer la survenue de phénomènes secondaires, physiques ou biologiques,inconstants mais visibles d’où différents types de technique :

-         Précipitation

-         Agglutination immunologique

-         Techniques du complément

-         Neutralisation

L’union des molécules d'Ag au Fab des anticorps, est un phénomène    constant mais invisible.

Cette union peut être mise en évidence par le marquage de l’Ag ou de l’Ac ce sont les techniques dites de marquage :

-         Immunofluorescence

-         Radio-immunologie

-         Immuno-enzymologie

                              I.            TECHNIQUES SANS MARQUAGE

1.   Méthodes de précipitation 

Le phénomène de précipitation se produit lorsque l’on met en contact un antigène soluble avec l’anticorps correspondant. Cette réaction se fait soit en milieu liquide soit en milieu gélifié. Le temps de réaction varie de moins d’une heure à plusieurs jours. La lecture peut se faire, soit à l’œil nu, soit avec des appareils tels que le néphélométrie ou le turbidimètre.

1-1 Précipitation en milieu liquide :

Immun néphélémétrie laser= Mesure de la diffusion de la lumière sous un angle différent de zéro (par rapport à l’axe de propagation de la lumière incidente)

Les particules dispersant la lumière sont des complexes immuns précipités en milieu liquide.

Il existe donc une relation entre l'intensité de la lumière mesurée par néphélémétrie et la quantité de précipité Ag-Ac.

Le dosage d’un Ag s’effectue par précipitation avec l’immun sérum spécifique et par référence à une courbe d’étalonnage préétablie avec des solutions d'Ag de concentrations croissantes connues. (Dosage de nombreuses protéines du sérum IgG, IgM, IgA, protéines du complément, ApoA et B...).

Le test est peu sensible (seuil 0,5mg/ml). Une variante permet de baisser le seuil de détection en utilisant des microparticules (latex par ex) sur lesquelles sont fixés des Ac (dosage des

IgE).

1-2 Précipitation en milieu gélifié :

Analyse qualitative de mélanges d’Ag, Immunodosage d’un Ag.

- Les solutions d’Ag et d’Ac diffusent dans le milieu gélifié à partir de réservoirs-->gradients réguliers de concentrations décroissantes

- A l’équivalence, précipitation du complexe Ag-Ac, le précipité retenu dans les mailles du gel sera lavé et éventuellement coloré.

2.   Agglutination immunologique

Agglutination immunologique = réunion en amas de particules à la suite d'une réaction Ag-Ac(suspension homogène de particules puis agrégats visibles à l'œil nu).

Restriction : Ag particulaire

Hémagglutination : repose sur la capacité de l’anticorps à agréger les GR grâce à la présence d’antigène à leursurface.

2-1 Théorie de l'agglutination :

Réaction complexe qui met en jeu des modifications des charges électriques à la surface des particules empêchant leur agglutination spontanée.

2-2 Conditions expérimentales :

Anticorps agglutinants :IgM surtout (10 à 100 fois plus que IgG)

Densité des sites antigéniques :relations entre agglutinabilité et densité en sites antigéniques.

Facteurs expérimentaux : température, pH (6 à 8), force ionique.

LES DIFFÉRENTS TYPES D’AGGLUTINATION :

1.AgglutinationACTIVE :

Définition : agglutination résultant d’une union spécifique entreun anticorpset un antigèneparticulaire appartenantnaturellement à la particule.

  

  

2.AgglutinationPASSIVE :

Définition:agglutination réalisée entre unanticorpset unantigènenormalement soluble, mais rendu particulairepar fixation sur un support.

 Particules :

- hématies (humaines groupe O, mouton, dinde) formolées = stables plusieurs mois à 4°C

- particules de latex (inertes et calibrées)

Fixation de l'antigène sur les particules :

Selon les particules et l’Ag à fixer : simple contact ou fixation chimique ou fixation immunologique. 

3.Agglutination DIRECTE :

Définition : agglutination réalisée entreun anticorpsagglutinant etun antigènegénéralement particulaire.

L'antigène est situé sur la face externe de la particule, sur une membrane cellulaire ou bactérienne, directement accessible par l'anticorps.

Ø  Détermination des groupes sanguins

Ø  Agglutination de bactéries (typage des salmonelles etc…)

4.Agglutination INDIRECTE ou ARTIFICIELLE :

Définition : agglutination réalisée entre unanticorps non agglutinantet unantigène(généralementparticulaire)avec utilisation d’un artifice.

Utilisation d'artifices techniques permettant de favoriser l'agglutinationou permettant la détection d'anticorps non agglutinants.

Substances macromoléculaires : Albumine, polyvinylpyrolidone, dextran

Enzymes protéolytiques : Papaïne, pepsine, broméline

5- Modalités techniques des réactions d'agglutination :

Réaction sur lame, en tubes, en microplaque, étude quantitative.

3.       Technique utilisant le complément

1- Etude du complément :

A.1 Réaction d'hémolyse :

Basée principalement sur la réaction d’immuno-hémolyse = le complément se fixe sur les complexes Ag-Ac et provoque la lyse de la membrane cellulaire des hématies.

1.2 Le système hémolytique :

= globules rouges de mouton / sérum de lapin anti-globules rouges de mouton

Mises en présence de complément (présent dans un liquide biologique à étudier) ces hématies sensibilisées vont être lysées--> libération de l’hémoglobine et lecture photométrique.

Relation entre le degré d’hémolyse et quantité de complément présent dans le liquide.

1.3 Applications :

Dosage du complément (et de ces composants) dans un liquide biologique.

2- Réaction de fixation du complément :

2.1 Principe :

2.2 Applications :

Sérodiagnostics d’infections bactériennes, virales, parasitaires par recherche et titrage d’Ac spécifiques présents à des concentrations inférieures à 1 mg/ml.

Détection des Ag d’histocompatibilité de classe I et II (groupage HLA) par la réaction demicrolymphocytotoxicité

- les lymphocytes sont mis en contact avec une “batterie”d’Ac anti-HLA de spécificité connue, pré-déposés dans les puits d’une plaque,

- après incubation on ajoute du sérum de lapin (= source de complément)

- les lymphocytes sont lysés dans les puits où les Ac se sont fixés sur les Ag HLA

(Visualisée par la pénétration d’un colorant normalement exclu des cellules vivantes).

4.   Réaction de neutralisation

Les Ag solubles macromoléculaires ou cellulaires sont aussi étudiés par le biais de leurs fonctions qui peuvent être inhibées par liaison avec leurs Ac spécifiques.

4.1- Neutralisation d'enzymes

Un Ac peut inhiber l'activité enzymatique d'une protéine quand le site enzymatique est identique ou proche du site antigénique.

Ceci est mis à profit pour la mise en évidence de certains Ac en bactériologie.

4.2- Neutralisation de toxines

Les Ac antitoxines neutralisent spécifiquement les effets biologiques des toxines.

4.3- Neutralisation des virus

Les Ac anti-virus peuvent neutraliser certaines propriétés des virus (neutralisation d'effets cytopathogènes sur des cultures cellulaires, inhibition de l'action hémagglutinante de certains virus sur certaines hématies. Ces observations peuvent permettre la détection et le dosage de certains Ac- antiviraux dans le sérum.