Coloration de gram

Introduction :

Coloration de Gram : elle est fondée sur l'action successive d'un colorant, le cristal violet, d'iode puis d'un mélange d'alcool et d'acétone.

Christian Gram (1853-1938) a été l’inventeur de la coloration en 1884.

Son intérêt est de donner une information rapide et médicalement importante, car le pouvoir pathogène et la sensibilité aux antibiotiques sont radicalement différents.

Elle permet de distinguer la paroi des bactéries ayant + du peptidoglycane. Coloration en 4 étapes

le but de coloration :

    Distinguer entre les bactéries  gram positifs et les bactéries gram négatifs

Mode opératoire : 

pour réaliser cette coloration on a besoin de :

Frottis :  étalement d’ échantillons sur une lame et le sécher

Les colorants:

•           Violet de gentiane

•           Lugol

•           Décolorant

•           Safranine

Chronomètre 

l’Étape 1: coloration par violet de gentiane 

laisser agir 1 minute puis rincer avec de l'eau

Le violet de gentiane colore le cytoplasme des bactéries.

l’Étape 2: mordançage par le lugol

Laisser agir 1 minute

Le Lugol (composé iodé) est un mordant qui permet de fixer le violet dans les bactéries.

l’Étape 3: décoloration par un solution décolorant 

 laisser agir de 5 à 10 s puis rincer avec l'eau

  La solution de décoloration contient un mélange d'alcool et d'acétone. Les pores de la paroi des Gram+ sont fermés par la déshydratation à l'alcool. La paroi est alors imperméable et le colorant violet reste dans les bactéries. La membrane des Gram- est dissoute par le mélange alcool-acétone. La paroi plus mince et de composition différente laisse alors sortir la coloration violette. 

l’Étape 4: coloration par la safranin

Pendant 1 minute puis rincer avec l'eau

Ce colorant permet de visualiser les bactéries Gram- décolorées à l'étape précédente. Cette coloration moins forte que le violet n'affecte pas la couleur des Gram+. 

Laisser sécher à l'air.

Observer au microscope à l'objet 100 avec huile d'immersion.

Observation :

E.Coli bacille a gram négative

Cocci a gram positive

bacille a gram négative et bacille a gram positive